Het laboratoriumonderzoek van auto-immuun blaarziekten.

Auto-immuun blaarziekten kunnen naar het niveau van blaarvorming worden onderverdeeld in twee hoofdgroepen, namelijk intra-epidermale blaarvorming bij pemphigus en subepidermale blaarvorming bij pemfigoïd. Het combineren van directe en indirecte immuunfluorescentie samen met serologisch onderzoek is noodzakelijk om bij auto-immuun blaarziekten tot een juiste diagnose te komen.

Directe immuunfluorescentie

Het biopt van de huid of slijmvlies van de patiënt is een belangrijk onderdeel van de diagnostiek naar auto-immuun blaarziekten. Het is het beste om het biopt perilesionaal, dat wil zeggen uit de roodheid naast de blaar, af te nemen. Aangezien immuunfluorescentie niet werkt op formaline gefixeerd materiaal is het noodzakelijk een biopt vers, het liefst op fysiologisch zout, in te sturen. Fysiologisch zout zorgt er namelijk voor dat ongewenste achtergrondaankleuring wordt verminderd (zie figuur 1). Indien verwacht wordt dat een biopt langer dan 24 uur onderweg zal zijn is het beter dit diepgevroren of op Michel’s fixatief in te sturen.

Het biopt wordt gekleurd op aanwezigheid van immuunglobulines en complement, waarbij wordt gekeken naar het patroon van aankleuring. Bij pemphigus wordt een aankleuring tussen de keratinocyten verwacht; een zogenaamd honingraatpatroon (figuur 2). Pemfigoïd toont een lineaire aankleuring langs de basaalmembraan. Hierbij kan een onderscheid gemaakt worden tussen een lineair n-serratie patroon (figuur 3), passend bij bulleus pemfigoid en de meeste andere vormen van pemfigoïd, of een u-serratie patroon, passend bij epidermolysis bullosa acquisita (figuur 4). Tenslotte kan ook een granulair patroon van IgA langs de basaalmembraan worden gevonden, hetgeen gezien wordt bij dermatitis herpetiformis (figuur 5).

Samen met de bevindingen van het serologisch onderzoek kunnen we auto-immuun blaarziekten verder sub-classificeren. Dit is belangrijk omdat elke vorm van een blaarziekte een andere prognose heeft en een andere behandeling behoeft.

Serologisch onderzoek

Het serologisch onderzoek is nodig om te bepalen of er circulerende antistoffen tegen eiwitten (antigenen) betrokken bij auto-immuun blaarziekten in het bloed van de patiënt aanwezig zijn. Hiervoor is een buisje stolbloed van de patiënt nodig. De combinatie van serologie en biopt verhoogt de sensitiviteit en specificiteit van het onderzoek naar auto-immuun blaarziekten.

Er worden 2 substraten gebruikt. In de eerste plaats apenoesofagus, waarbij 2 patronen kunnen worden onderscheiden. De antistoffen in pemphigus serum zullen binden aan de epitheelcellen, hetgeen resulteert in een kippengaaspatroon (figuur 6). In het geval van pemfigoid zullen de antistoffen binden ter plekke van de basaalmembraan, een lineair patroon gevend (figuur 7).

Het andere substraat is humane zoutgespleten huid. Door huid van gezonde personen gedurende 24 uur met hoog molair natriumchloride te incuberen ontstaat een splijting ter plekke van de basaalmembraan zone. Bepaalde eiwitten betrokken bij auto-immuun blaarziekten zullen zich in het dak van de splijting bevinden (figuur 8), onder ander BP180 en BP230, terwijl andere eiwitten in de bodem zitten, zoals collageen 7 en laminine 332 (figuur 9). Incubatie met serum van pemfigoid patiënten kan dan een dak of bodem aankleuring geven, afhankelijk van het antigeen waartegen de antistoffen gericht zijn.

Bij zowel pemphigus als pemfigoid is het noodzakelijk om aanvullende testen, zoals ELISA en immunoblot, uit te voeren om het betrokken antigeen in meer detail te kunnen determineren.

Aanvullend serologisch onderzoek

Enzyme-Linked Immuo Sorbent Assay (ELISA) is een laboratoriumtest waarmee de hoeveelheid antilichamen in het bloed tegen een bepaald auto-antigeen kan worden gemeten. Het voordeel hiervan is dat de ziekteactiviteit gemonitord kan worden om te zien of de ingestelde medicatie werkzaam is, of dat er een risico op een relapse is.  Het laboratorium beschikt over anti-desmogleïne 1 en anti-desmogleïne 3 ELISA’s  (pemphigus) en anti-NC16A en anti-BP230 ELISA’s (pemfigoïd).

Alle sera met een differentiaaldiagnose van pemphigus of pemfigoïd worden routinematig met ELISA gescreend of er inderdaad antilichamen tegen een auto-antigeen aanwezig zijn. Van patiënten die onder behandeling staan van het UMCG wordt bij elk bezoek de antilichaamtiter gecontroleerd.

Immunoblot is een test waarbij serum van een patiënt op een nitrocellulosemembraan wordt gebracht waarop zich op grootte gesorteerde huideiwitten bevinden. Indien het serum antilichamen bevat, welke gericht zijn tegen een van deze eiwitten, dan zullen deze er aan binden. Dit kan met een kleurmethode zichtbaar worden gemaakt en op basis van de positie waar het IgG is gebonden kan een diagnose worden gesteld (figuur 10). De techniek is bij pemfigoïd vooral geschikt om antilichamen tegen BP180 (het antigeen waar de meeste pemfigoïd patiënten antilichamen tegen maken) aan te tonen. Daarnaast is het een zeer adequate test om paraneoplastische pemphigus aan te tonen omdat het antilichamen tegen periplakine en envoplakine zichtbaar kan maken. De initiële diagnostiek bij verdenking op paraneoplastische pemphigus is immunoblot en indirecte immunofluorescentie op rattenblaas. Indien de uitkomst hiervan niet eenduidig is, wordt het serum met immunoprecipitatie getest. Immunoprecipitatie is een uiterst gevoelige, maar ook bewerkelijke test die zeer lage concentraties antilichamen in het bloed kan aantonen. Drie auto-antigenen die specifiek zijn voor paraneoplastische pemphigus zijn  de combinatie envoplakine en periplakine en/of het eiwit A2ML1 (figuur 11). Per patiënt kan de antilichaamrespons verschillen. 

Speciale serologische onderzoeken

Indien mogelijk kunnen extra testen worden uitgevoerd als de uitkomsten uit bovengenoemde technieken niet eenduidig zijn. Het laboratorium immunodermatologie beschikt over een aantal testen die door het laboratorium zelf zijn ontwikkeld. De In Vitro Bindings Assay (ivba) is een test voor pemphigus die antistoffen aantoont gericht tegen desmosomen. Aan gekweekte keratinocyten wordt patiëntenserum toegevoegd. Als er anti-desmosomale antistoffen aanwezig zijn zullen deze aan de desmosomen binden wat met immunofluorescentie zichtbaar kan worden gemaakt (figuur 12). Deze test toont ook de aanwezigheid van antistoffen als serologie op apenoesofagus en ELISA negatief zijn. Patiënten die negatieve ELISA waardes hebben kunnen met deze test gevolgd worden voor de aanwezigheid van antilichamen.

De Keratinocyte Footprint Assay (KFA) is het meest recentelijk door ons ontwikkeld. Met deze test kunnen antilichamen aangetoond worden in het bloed gericht tegen laminine-332. Keratinocyten in kweek kruipen over het glas waar ze op gekweekt worden. Zoals een slak een slijmspoor na laat doen keratinocyten dat ook. Dit spoor bevat laminine-332. Als serum van een patiënt met anti-laminine-332 antistoffen op zo’n glaasje wordt gebracht zullen de auto-antilichamen aan dit spoor binden en dat kan met immunofluorescentie zichtbaar worden gemaakt (figuur 13). Aangezien de sporen geen andere auto-antigenen bevatten is de test 100% specifiek voor de diagnose anti-laminine-332 slijmvliespemfigoïd. In vergelijking met andere anti-laminine-332 testen is deze test ook het meest sensitief.